Artykuł przeglądowy

Laboratoryjna diagnostyka nieimmunologicznych niedokrwistości hemolitycznych – membranopatie

Laboratory diagnostics of the inherited hemolytic anemias – membranopathies

Olga Ciepiela

Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Współczesna Medycyna Laboratoryjna 2019; 1 (1): 16-21

Streszczenie

Wrodzone niedokrwistości hemolityczne są grupą chorób, które łączą wspólne objawy pomimo odmiennej etiopatologii zaburzeń. Najczęściej diagnoza stawiana jest we wczesnym dzieciństwie, jednak u części chorych o małym nasileniu objawów, zaburzenie może być rozpoznane w późniejszych dekadach życia. Membranopatie stanowią grupę wrodzonych niedorkwistości hemolitycznych, u których podłoża leżą zaburzenia budowy błony krwinki czerwonej i jej cytoszkieletu. Do podstawowych metod diagnostycznych w niedokrwistościach wrodzonych należą analiza wyniku morfologii i rozmazu krwi. Rozszerzone badania pozwalają na rozpoznanie przyczyny obserwowanych zaburzeń. Najczęściej występującymi niedokrwistościami z grupy membranopatii są sfercytoza wrodzona, dziedzina eliptocytoza i dziedziczna stomatocytoza.

Słowa kluczowe: eliptocytoza, niedokrwistość, membranopatie, owalocytoza, sferocytoza, stomatocytoza.

Abstract

Inherited hemolytic anemias are diseases with different pathogenesis but common symptoms. First diagnosis of inborn defect of red blood cells is obtained in early childhood, however patients with mild form of the disease or just traits can be diagnosed later or even remain undiagnosed. In the course of membranopathies defects of plasma membrane or cytoskeleton proteins are recognized. Screening tests for inborn membranopathies include analysis of complete blood count and peripehral blood smear. More advance methods, specifically detecting molecular defects of erythrocytes are necessary to obtain final diagnosis. Among membranopathies the most frequent are hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis and hereditary stomatocytosis.

Key words: anemia, elliptocytosis, membranopathies, ovalocytosis, spheroytosis, stomatocytosis.

Wprowadzenie

Wrodzone niedokrwistości hemolityczne są grupą chorób, które łączą wspólne objawy pomimo odmiennej etiopatologii zaburzeń. Najczęściej diagnoza stawiana jest we wczesnym dzieciństwie, jednak u części chorych o małym nasileniu objawów zaburzenie może być rozpoznane w późniejszych dekadach życia lub pozostać niezdiagnozowane. Badania w kierunku niedokrwistości hemolitycznych obejmują analizy hematologiczne, immunologiczne i biochemiczne, których celem jest potwierdzenie hemolizy oraz rozpoznanie przyczyny skróconego życia erytrocytów. Wśród najczęściej występujących wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych dominują zaburzenia budowy błony komórkowej erytrocytów (np. sferocytoza wrodzona), talasemie, hemoglobinopatie (np. niedokrwistość sierpowatokrwinkowa). Rzadziej rozpoznawane są enzymopatie (np. niedobór kinazy pirogronianowej) czy nocna napadowa hemoglobinuria [1].

Wśród pacjentów trafiających pod opiekę lekarza w Polsce coraz częściej zdarzają się osoby, które prezentują objawy charakterystyczne dla wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych typowych dla basenu Morza Śródziemnego czy Bliskiego Wschodu. Dlatego wiedza na temat diagnostyki tych jednostek chorobowych powinna być rozpowszechniona wśród diagnostów laboratoryjnych pracujących zarówno w laboratoriach zajmujących się diagnostyką pediatryczną, jak i osób dorosłych.

Podstawowymi parametrami laboratoryjnymi, dzięki którym rozpoznaje się u pacjenta hemolizę wewnątrznaczyniową jest zwiększone stężenie bilirubiny i potasu w surowicy, podwyższona aktywność dehydrogenazy mleczanowej (lactate dehydrogenase – LDH) i zmniejszone stężenie haptoglobiny w osoczu. W wyniku morfologii krwi obwodowej najczęściej nieznacznemu stopniowi niedokrwistości (obniżenie stężenia hemoglobiny) towarzyszy retikulocytoza oraz podwyższony wskaźnik anizocytozy (red blood cell distribution width – RDW). U pacjentów, u których występują łagodne objawy lub jedynie nosicielstwo wady genetycznej, można obserwować prawidłowe wyniki parametrów hematologicznych (skompensowana niedokrwistość), a w rozmazie krwi będą widoczne dyskretne zmiany dotyczące typowych dla tych jednostek chorobowych form krwinek czerwonych. Dlatego tak istotne jest opisanie w wyniku rozmazu krwi obwodowej wszelkich zmian – nieznacznego stopnia anizocytozy i poikilocytozy, z pojedynczymi sferocytami, krwinkami tarczowatymi, owalocytami czy echinocytami.

Wyniki podstawowych badań laboratoryjnych wraz z pojawiającymi się u pacjenta objawami są podstawą do skierowania pacjenta na rozszerzone badania hematologiczne dostępne w wielu laboratoriach – test wiązania maleimidu 5’-eozyny (test EMA), ocena oporności osmotycznej krwinek czerwonych, ocena zawartości hemoglobiny A2 (HbA2), hemoglobiny płodowej (HbF) i hemoglobiny S (HbS) lub innych jej wariantów, czy też bezpośredniego testu antyglobulinowego (BTA, odczyn Coombsa) przeprowadzanego w celu wykluczenia niedokrwistości o podłożu immunologicznym (obecność na krwinkach czerwonych immunoglobulin lub składowych układu dopełniacza). Do ostatecznego rozpoznania choroby niezbędne będą badania genetyczne, które pozwolą na wykrycie typowych mutacji genetycznych związanych z występowaniem konkretnego fenotypu choroby. U części pacjentów nie udaje się znaleźć dysfunkcyjnego genu, jednak objawy i typowe wyniki podstawowych i rozszerzonych badań laboratoryjnych mogą być podstawą do ustalenia rozpoznania. W literaturze światowej z zakresu hematologii regularnie opisywane są nowe mutacje genetyczne w obrębie loci związanych czy to z białkami błonowymi erytrocytu, czy łańcuchami hemoglobin. Dzięki temu pacjenci, u których pierwotnie nie znaleziono mutacji genetycznych będących przyczyną występowania objawów choroby, mogą być zdiagnozowani w późniejszych etapach życia [2].

Zaburzenia białek błonowych krwinek czerwonych

Sferocytoza wrodzona

Najczęściej występującą na terenie północnej Europy i Ameryki Północnej niedokrwistością, u podstaw której leżą zaburzenia w budowie błony komórkowej erytrocytu, jest sferocytoza wrodzona (hereditary spherocytosis – HS). Częstość występowania szacuje się na 1/2000 osób. Mutacje genetyczne powodujące HS dotyczą genów kodujących białka błonowe, najczęściej ankirynę, białko pasma 3, α i β spektrynę oraz białko 4.2 [3, 4]. Pierwszym objawem HS u noworodków jest przedłużająca się hiperbilirubinemia. Nieleczona może prowadzić do rozwoju żółtaczki jąder podkorowych zwanej inaczej encefalopatią bilirubinową. Jako podstawowe badania przesiewowe w diagnostyce HS wykorzystywane są: ocena rozmazu krwi obwodowej, w której zaznaczona jest anizocytoza i poikilocytoza (występowanie sferocytów i mikrosferocytów; ryc. 1.) oraz morfologia krwi, w której uwagę zwraca różnego stopnia niedokrwistość (zależna od nasilenia choroby oraz występującej u pacjenta wady genetycznej) przy podwyższonych wskaźnikach RDW i MCHC (średnie stężenie hemoglobiny w krwince)

Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) pozostaje w zakresie wartości referencyjnych. Podwyższenie MCHC wynika z charakterystycznego kształtu krwinki czerwonej – niedobór białek błonowych i białek cytoszkieletu skutkuje przyjęciem przez erytrocyt kształtu kulistego (sferocyt). Średnie stężenie hemoglobiny w krwince, którego pomiar odbywa się na zasadzie oceny objętości krwinki czerwonej zdeformowanej (spłaszczonej) w układzie pomiarowym analizatora, w sferocytach będzie zwiększone, ponieważ krwinka o kształcie kulistym, ze względu na zaburzony stosunek powierzchni komórki do jej objętości, nie może zmieniać swojego kształtu w trakcie pomiaru. Poza podstawowymi parametrami czerwonokrwinkowymi, do przesiewowej diagnostyki HS przydatny jest taki parametr, jak MSCV, czyli objętość erytrocytu w hipoosmotycznym środowisku, wprowadzony do analizatorów Beckman Coulter. Niska wartość MSCV z dużą czułością i swoistością pozwala rozpoznać pacjentów z objawami sferocytozy wrodzonej. Dużą przydatność w przesiewowej diagnostyce HS mają parametry retikulocytarne, w tym stosunek całkowitej liczby retikulocytów do frakcji retikulocytów niedojrzałych (IRF; Ret/IRF), wskaźnik hiper-He wskazujący na obecność retikulocytów o wysokiej zawartości hemoglobiny czy obecność mikrocytów (MicroR). Wykorzystanie algorytmów diagnostycznych opartych na ocenie różnych parametrów czerwonokrwinkowych i retikulocytarnych znacznie zwiększa ich przydatność diagnostyczną do wykrywania HS (tab. 1.) [2, 3, 5, 6].

Kolejnym testem przesiewowym o wysokiej czułości przy nieco obniżonej swoistości jest ocena oporności osmotycznej erytrocytów. Obecnie test ten może być przeprowadzony w formie klasycznego testu lizy erytrocytów w szeregu rozcieńczeń soli fizjologicznej, jako zmodyfikowany test Dacie’go (test lizy erytrocytów w zakwaszonym roztworze glicerolu – AGLT50) czy w formie najbardziej nowoczesnego cytometrycznego testu oporności erytrocytów (FC-OF). Test ten po raz pierwszy opisany w 2009 r. Wprowadzono go w wielu ośrodkach diagnostyki hematologicznej na świecie, ze względu na krótki czas wykonania, wysoką czułość i swoistość w wykrywaniu HS oraz dużą przydatność do wykrywania talasemii. Zasada przeprowadzania FC-OF jest bardzo prosta – do zawiesiny krwinek czerwonych, których liczba została określona w czasie ok. 30 sekund, w trakcie pomiaru cytometrycznego dodawana jest dejonizowana woda. Po dodaniu wody pomiar liczby krwinek czerwonych w zawiesinie jest kontynuowany. Ostateczny wynik testu oparty jest na wyznaczeniu stosunku uśrednionej liczby krwinek czerwonych zliczonych przez aparat w ciągu dwóch ostatnich 30-sekundowych okresów zliczeniowych (bramek) pomiaru do liczby krwinek czerwonych znajdujących się w zawiesinie przed dodaniem do niej wody, zliczonych w ciągu 30 sekund (ryc. 2.). Wartość tego stosunku poniżej 18% z dużym prawdopodobieństwem wskazuje na sferocytozę wrodzoną [7, 8]. Test FC-OF jest stale rozwijany, badane są różne czasy analizy zawiesiny, różne stężenia NaCl, w których zawieszane są erytrocyty, oraz różne objętości wody, które dodawane są do próbki [8]. Obecnie przydatność tego testu do wykrywania HS jest bardzo wysoka, czułość testu sięga 90%, a swoistość 84,6% [7]. Niewykluczone, że postęp w tej dziedzinie będzie skutkował zwiększoną dostępnością testu oporności osmotycznej, którego główna zasada polega na zliczaniu krwinek w zawiesinie, a nie na ocenie stopnia hemolizy przez pomiar absorbancji próbki, jak ma to miejsce podczas wykonywania AGLT50.

O wiele rzadziej wykorzystywaną metodą w diagnostyce HS jest test kriohemolizy, w którym obserwuje się nadmierny rozpad sferocytów w temperaturze 0°C w środowisku hiperosmotycznym. Test ten wykazuje większą swoistość dla HS niż test oporności osmotycznej, ponieważ wykrywa hemolizę zależną od zaburzonej budowy błony komórkowej, nie zaś od zaburzonego stosunku objętości krwinki do jej powierzchni, co obserwuje się również w sferocytach obecnych w przebiegu niedokrwistości autoimmunohemolitycznej. Jednak w licznych doniesieniach dotyczących testu kriohemolizy rozbieżności w uzyskiwanych wartościach parametrów diagnostycznych testu są na tyle duże, że nie znalazł się on w grupie analiz przydatnych do badań przesiewowych w kierunku HS w ostatnich wytycznych Międzynarodowej Rady ds. Standaryzacji w Hematologii (International Council for Standarization in Hematology – ISCH), które ukazały się w 2015 r. [2].

Kolejnym badaniem, do którego przeprowadzenia niezbędna jest specjalistyczna aparatura, jest ektacytometria w gradiencie osmotycznym. Metoda ta pozwala na odróżnienie HS od innych niedokrwistości wynikających z zaburzonej struktury błony komórkowej erytrocytu i polega na pomiarze stosunku powierzchni krwinki do jej objętości, ocenie zmian kształtu krwinki w gradiencie osmotycznym oraz pomiarze stopnia uwodnienia krwinek [2, 6]. W trakcie pomiaru ektacytometrycznego dla poszczególnych membranopatii uzyskiwane są typowe krzywe odkształcalności (deformability index profile – DI). Analiza DI obejmuje ocenę trzech głównych parametrów – maksimum wysokości DI (DI_max), lokalizację punktu lizy osmotycznej (0 min) w różnych stężeniach NaCl oraz stopnia odwodnienia krwinki (0 hyper; ryc. 3.).

W przypadku HS krzywa DI przebiega niżej niż krzywa typowa dla prawidłowych krwinek (obniżenie DI_max), a zmniejszona oporność na lizę osmotyczną skutkuje przesunięciem punktu 0 min w kierunku wyższej osmolalności zawiesiny.

Wiarygodny pomiar krzywej DI zależy od wielu czynników – próbka krwi poddawana analizie musi być świeża (przechowywanie erytrocytów będzie skutkowało zaburzeniem ich stopnia nawodnienia, a co za tym idzie – odkształcalności mierzonej ektacytometrycznie), a przed badaniem należy wykluczyć podłoże autoimmunologiczne niedokrwistości, gdyż przeciwciała obecne na powierzchni krwinek czerwonych zakłócają odczyty wszystkich badanych parametrów [2].

Obecnie najbardziej czułym i swoistym testem pozwalającym wykryć sferocytozę wrodzoną, wykonywanym w ośrodkach diagnostycznych wyposażonych w cytometr przepływowy jest test wiązania maleimidu-5’-eozyny (test EMA). Fluorescencyjny barwnik EMA wiąże się z dużą swoistością do białka pasma 3. W przypadku zmniejszenia zawartości tego białka w błonie erytrocytu (co ma miejsce również przy niedoborze pozostałych białek błonowych i cytoszkieletu krwinki, ponieważ występują one w kompleksach) fluorescencja krwinek związanych z EMA się zmniejsza. Stopień zmniejszenia fluorescencji ocenia się, porównując wyniki analizy wybarwionych krwinek pacjenta z wynikami analiz 5–6 wybarwionych próbek kontrolnych. Jeżeli średnia fluorescencja krwinek pacjenta związanych z EMA jest niższa niż 81% fluorescencji krwinek kontrolnych, rozpoznanie HS jest wysoce prawdopodobne (ryc. 4.). Czułość testu EMA przekracza 95%, co oznacza, że jedynie pojedyncze przypadki HS nie będą rozpoznane za pomocą tej metody. Tak znaczące obniżenie fluorescencji erytrocytów w teście EMA jak w przebiegu HS wykrywa się również w nielicznych przypadkach niedokrwistości dyserytropoetycznej typu II (CDA II) czy owalocytozy Azji Południowo-Wschodniej, jednak ostateczna analiza elektroforezy białek erytrocytu pozwoli na odróżnienie tych jednostek chorobowych [3, 5].

Po uzyskaniu pozytywnych wyników badań przesiewowych ostateczne rozpoznanie choroby i jej przyczyny ustala się na podstawie wyników wysoce swoistych testów – SDS-elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) białek błonowych erytrocytów, w której brak prążka odpowiadającemu określonemu białku erytrocytu pozwala rozpoznać jego niedobór; i analizy molekularnej mutacji genetycznych w obrębie loci genów dla poszczególnych białek błony komórkowej i cytoszkieletu [2].

Piśmiennictwo
1. Bolton-Maggs PH, Langer JC, Iolascon A i wsp.; General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in H. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis – 2011 update. Br J Haematol 2012; 156: 37–49.
2. King MJ, Garcon L, Hoyer JD i wsp. ICSH gu¬idelines for the laboratory diagnosis of no¬nimmune hereditary red cell membrane di¬sorders. Int J Lab Hematol 2015; 37: 304–325.
3. Farias MG. Advances in laboratory diagno¬sis of hereditary spherocytosis. Clin Chem Lab Med 2017; 55: 944–98.
4. Narla J, Mohandas N. Red cell membrane disorders. Int J Lab Hematol 2017; 39 Suppl 1: 47–52.
5. Ciepiela O. Old and new insights into the diagnosis of hereditary spherocytosis. Ann Transl Med 2018; 6: 339.
6. Spychalska J. Membranopatie krwinek czerwonych – patogeneza, obraz kliniczny i diagnostyka. Hematologia 2012; 3: 81–119.
[…]